實驗室建設-工藝規範

發布日期:2018/6/7 23:33:53

    基因擴增檢驗實驗室的規範化設置

  臨床基因擴增檢驗實驗室的規範化設置詳見《臨床基因擴增檢驗實驗室管理暫行辦法》(衛醫發[2002]10號文)附件《臨床基因擴增檢驗實驗室基本設置標準》。為避免汙染,必須嚴格遵循《臨床基因擴增檢驗實驗室設置標準》設置臨床基因擴增檢驗實驗室。 臨床基因擴增檢驗實驗室四個隔開的工作區域中每一區域都須有專用的儀器設備。各區域都必須有明確的標記,以避免設備物品如加樣器或試劑等從其各自的區域內移出從而造成不同的工作區域間設備物品發生混淆。進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向順序,即隻能從試劑貯存和準備區、標本製備區、擴增反應混合物配製和擴增區(簡稱擴增區)至產物分析區,避免發生交叉汙染。在不同的工作區域應使用不同顏色或有明顯區別標誌的工作服,以便於鑒別。此外,當工作者離開工作區時,不得將各區特定的工作服帶出。 清潔方法不當也是汙染發生的一個主要原因,因此實驗室的清潔應按試劑貯存和準備區至擴增產物分析區的方向進行。不同的實驗區域應有其各自的清潔用具以防止交叉汙染。 

  (一)試劑貯存和準備區 

  下述操作在該區進行:貯存試劑的製備、試劑的分裝和主反應混合液的製備。 

  貯存試劑和用於標本製備的材料應直接運送至試劑貯存和準備區,不能經過產物分析區。在打開含有反應混合液的離心管或試管前,應將其快速離心數秒。試劑原材料必須貯存在本區內,並在本區內製備成所需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經檢查可用後,應將其分裝貯存備用,避免由於經常打開反應管吸液而造成汙染。 

含反應混合液的離心管或試管在冰凍前都應快速離心數秒。大多數用於擴增的試劑都應冰凍貯存。為避免因單次反應取液而頻繁的凍融主貯存試劑,應分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據通常在實驗室內一次測定所需的擴增反應數來決定。 

  主反應混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩定性通過預試驗來檢查,評價結果必須有書麵報告。對於"熱啟動"技術(在第一個高溫變性步驟後加入酶),聚合酶也可不包含在主反應混合液中。 

在整個本區的實驗操作過程中,操作者必須戴手套,並經常更換。此外,操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止汙染的措施。 嚴禁用嘴吸取液體,加樣器和吸頭等必須經高壓處理。 

  工作結束後必須立即對工作區進行清潔。本工作區的實驗台表麵應可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質的消毒清潔作用。實驗台表麵的紫外照射應方便有效。由於紫外照射的距離和能量對去汙染的效果非常關鍵,因此可使用可移動紫外燈(254nm波長),在工作完成後調至實驗台上60~90cm內照射。由於擴增產物僅幾百bp,對紫外線損傷不敏感,因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間,最好是照射過夜。實驗室及其設備的使用必須有日常記錄。 

  (二)標本製備區 

  下述操作在該區進行:臨床標本的保存,核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。 要正確使用加樣器。由於在加樣操作中可能會發生氣溶膠所致的汙染,所以應避免在本區內不必要的走動。可通過在本區內設立正壓條件避免從鄰近區進入本區的氣溶膠汙染。為避免樣本間的交叉汙染,加入待測核酸後,必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料,必須有明確的樣本處理和滅活程序。 用過的加樣器吸頭必須放入專門的消毒(例如含次氯酸鈉溶液)容器內。實驗室桌椅表麵每次工作後都要清潔,實驗材料(原始血標本、血清標本、提取中的標本與試劑的混合液等)如出現外濺,則必須分別處理並作出記錄。 對實驗台適當的紫外照射(254nm波長,與工作台麵近距離)適合於滅活去汙染。可移動紫外線管燈可用來確保工作後對實驗台麵的充分照射。 樣本處理對核酸擴增有很大影響,必須使用有效的核酸提取方法,可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價。 用於RNA擴增檢測樣本製備好以後,應立即進行cDNA合成,因為cDNA鏈較RNA穩定,保存相對容易。為保證逆轉錄反應的需要,應在標本製備區設置一個以上的溫育裝置。 cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定,傾向於使用一步法:即使用在擴增反應緩衝液條件下具有逆轉錄活性的熱穩定的DNA聚合酶進行逆轉錄,其較cDNA合成後再開蓋以調節緩衝液或加入聚合酶進行擴增發生汙染的可能性降低。 待測RNA的cDNA拷貝須保存在標本製備區,不得在本區對樣本進行PCR擴增。 

  (三)擴增區 

  下述工作在本區內進行:DNA或cDNA擴增。此外,已製備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本製備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和製備區)製備成反應混合液等也可在本區內進行。在巢式PCR測定中,通常在第一輪擴增後必須打開反應管,因此巢式擴增有較高的汙染危險性,第二次加樣必須在本區內進行。 不能從本區再進入任何"上遊"區域,可降低本區的氣壓以避免氣溶膠從本區漏出。 為避免氣溶膠所致的汙染,應盡量減少在本區內的走動。如有加樣則應在超淨台內進行。打開預處理過的反應混合液時必須防止液體濺出,尤其是在巢式擴增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應管前快速離心數秒。可使用體積較小的離心機,因其所占實驗台麵小,易於用一隻手操作,適合於大多數超淨台。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防汙染作用,但必須注意的是,礦物油本身也可能成為一種持續性的汙染源。用過的加樣器必須注意清潔消毒。 完成操作及每天工作後都必須對實驗室台麵進行清潔和消毒,紫外照射方法與前麵區域相同。如有溶液濺出,必須處理並作出記錄。 

  (四)擴增產物分析區 

  下述操作在本區內進行:擴增片段的測定。 核酸擴增後產物的分析方法多種多樣,如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標記或非同位素標記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉移、核酸測序方法等。目前國內的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標記的微孔板上探針雜交方法,即PCR-ELISA方法,也有膜上探針雜交方法。 本區是最主要的擴增產物汙染來源,因此必須注意避免通過本區的物品及工作服將擴增產物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產物時,必須使用洗板機洗板,廢液必須收集至1mol/L HC1中,並且不能在實驗室內傾倒,而應至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡後再放到垃圾袋中按程序處理,如焚燒。 

由於本區有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等,故應注意實驗人員的安全防護。 本區的清潔消毒和紫外照射方法同前麵區域。本區如采用負壓條件或減壓情況下(如安裝排風扇)可減少擴增產物從本區擴散至前麵區域的可能性。

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